動物疫病檢測，作為健康養(yǎng)殖的關(guān)鍵一環(huán)，在整體疫病預(yù)防控制中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，具有提前預(yù)警評估風(fēng)險(xiǎn)，有效預(yù)防和減少疾病的發(fā)生等價(jià)值。為支持客戶精準(zhǔn)防控，健康養(yǎng)殖，信得科技引進(jìn)了宋慶慶博士、涂亞斌博士、劉春國博士、李秋博士等一批青年科學(xué)家，致力于將更多新穎想法與研究成果融入到產(chǎn)品研發(fā)和生產(chǎn)實(shí)踐中，從而有效帶動信得科技的技術(shù)水平實(shí)現(xiàn)不斷提高與突破。
近年來，信得科技疫病檢測實(shí)力不斷提升，建有CNAS標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室，現(xiàn)有30余位檢測精英，配備110余臺（套）儀器和設(shè)備，年檢測樣本14萬余份。在劉春國博士的帶領(lǐng)和培養(yǎng)下，信得檢測人才迅速成長，并于近日在國際家禽領(lǐng)域top期刊《家禽科學(xué)》上發(fā)表了以王雪博士為第一作者，劉春國博士為通訊作者的最新研究成果“同時(shí)檢測MG ts-11疫苗株和非ts-11株的Cycleave雙探針熒光定量PCR方法的開發(fā)和應(yīng)用”（https://doi.org/10.1016/j.psj.2024.103907）。該研究建立的cycleave雙探針熒光定量PCR方法具有良好的特異性、敏感性和重復(fù)性，為MG ts-11疫苗株和非ts-11株的快速高效鑒別診斷提供了有力的技術(shù)支撐。
以下為論文發(fā)表全文
同時(shí)檢測MG ts-11疫苗株和非ts-11株的Cycleave雙探針熒光定量PCR方法的開發(fā)和應(yīng)用
王雪，孫娜娜，王猛，王慧，劉雨涵，石豪，朱浩，李培東，張富友，楊天耀，李朝陽，劉春國
摘要：雞敗血支原體（MG）ts-11活疫苗已成為預(yù)防和控制MG感染的有效方法。然而，ts-11株通常難以與非ts-11株，包括野毒株和其他疫苗株（F和6/85）進(jìn)行區(qū)分。因此，建立一種快速有效的方法來區(qū)分ts-11株和非ts-11株至關(guān)重要。根據(jù)ts-11株pot C基因中存在一個(gè)單點(diǎn)突變的保守區(qū)域，我們設(shè)計(jì)一對引物及鑒別疫苗毒和野毒的兩條探針。該方法能夠準(zhǔn)確、高效地鑒別ts-11和非ts-11株，最低檢測限分別為2.43拷貝/μL和1.6拷貝/μL。此外，該方法也具有良好的特異性，禽流感病毒、傳染性支氣管炎病毒、新城疫病毒、禽腺病毒、傳染性喉氣管炎病毒、傳染性法氏囊病病毒、雞貧血病毒、馬立克氏病病毒、滑液囊支原體和鼻氣管鳥桿菌檢測結(jié)果均為陰性。臨床樣品檢測結(jié)果表明，該方法可有效進(jìn)行ts-11和非ts-11株的混合感染或單一感染的檢測區(qū)分，而且批內(nèi)和批間變異系數(shù)較低。本研究建立的cycleave雙探針熒光定量PCR方法具有良好的特異性、敏感性和重復(fù)性，為MG ts-11和非ts-11株的快速高效鑒別診斷提供了有力的技術(shù)支撐。
關(guān)鍵詞：雞敗血支原體（MG），cycleave熒光定量PCR，鑒別診斷，ts-11株
引言
目前，已知有約23種支原體存在于鳥類中。其中，最主要和最常見的感染雞的支原體包括雞敗血支原體（MG）和滑液囊支原體（MS）（Dhondt等，1998; Ross等，2014）。MG是雞和其他禽類（Wang等，2022）慢性呼吸道疾病（CRD）的主要病原體。由于MG感染后可對家禽養(yǎng)殖業(yè)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失，MG被認(rèn)為是影響家禽（Mugunthan等，2023）經(jīng)濟(jì)價(jià)值的最主要的致病性支原體。MG感染呈全球分布，已被世界動物衛(wèi)生組織（WOAH）所收錄。MG可導(dǎo)致火雞傳染性鼻竇炎，北美雀類結(jié)膜炎。MG也可引起一些鳥類發(fā)病，包括美國金雀、紫雀和麻雀，以及一些觀賞性鳥類，包括雉類、鷓鴣和石雞（Mugunthan等，2023）。在雞群中，MG不僅引起CRD，還可與大腸桿菌和低致病性禽流感病毒等協(xié)同感染，引起呼吸道疾?。∟aylor等，1992）。由于MG在禽類中具有較高的致病性，給養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，因此，提高M(jìn)G的診斷和防治水平至關(guān)重要。
MG可以水平傳播和垂直傳播。水平傳播主要通過飛沫、唾液、攜帶MG的氣溶膠以及被污染的飼料和飲用水；通過雞胚的垂直傳播偶爾發(fā)生。雞群中MG感染很難徹底清除，導(dǎo)致MG感染在雞群中長期存在并廣泛傳播，使得MG感染的防控更加困難。
疫苗免疫是預(yù)防MG感染的重要策略。目前，6/85、ts-11和F株是世界范圍內(nèi)使用的主要活疫苗株。F菌株毒力強(qiáng)，對肉雞和火雞均有致病性。6/85株和ts-11株是非常安全的，對未免疫雞群的潛在傳播風(fēng)險(xiǎn)較低（Noormohammadi and Whithear，2019; Vance等，2008）。ts-11疫苗由澳大利亞生物資源公司研制（Whithear等，1990）。ts-11株的最適生長溫度為33℃，相關(guān)研究表明在39.5℃時(shí)疫苗株增殖能力下降，說明ts-11株對溫度敏感。與親本株（80083株）相比，ts-11株高度致弱，可能對雞無致病性。此外，ts-11株在鳥類間的水平傳播能力也較低。研究表明，ts-11疫苗對MG強(qiáng)毒株引起的呼吸道疾病和產(chǎn)蛋下降具有保護(hù)作用（Armour and Ferguson-Noel，2015）。相反，F(xiàn)株能夠在肉雞中傳播并引起呼吸道癥狀（Vance等，2008; Rodriguez and Kleven，1980）。隨著ts-11疫苗的廣泛使用，區(qū)分疫苗株與非疫苗株已成為養(yǎng)殖業(yè)的迫切需求。常規(guī)的病原體分離培養(yǎng)方法無法有效區(qū)分疫苗株和非疫苗株。目前，我國缺乏直接、快速、靈敏和定量的方法來評估疫苗免疫后ts-11株的定植情況（Sulyok等，2019）。因此，建立有效的檢測方法來區(qū)分MG ts-11株與非ts-11株是控制MG感染的關(guān)鍵。
Cycleave熒光PCR已應(yīng)用于畜牧業(yè)、獸醫(yī)以及布病和肺癌等人類疾病的研究（Fujita等，2015; Nan等，2016）。該方法不同于傳統(tǒng)的熒光定量PCR，它結(jié)合循環(huán)探針技術(shù)提高了特異性。Cycleave PCR檢測可以實(shí)時(shí)檢測單核苷酸多態(tài)性。利用嵌合RNA-DNA 探針和RNase H來檢測目標(biāo)核苷酸。嵌合探針含有一個(gè)RNA堿基，當(dāng)探針與互補(bǔ)DNA序列形成雜合體時(shí)，該堿基可以被RNase H切割，探針裂解發(fā)出熒光信號。如果探針的RNA部分或一個(gè)RNA堿基與模板不匹配，RNase H 無法切割探針的RNA部分。在本研究中，開發(fā)了一種cycleave雙探針熒光定量PCR（cycleave qPCR）方法來區(qū)分MG ts-11株和非ts-11株。利用RNA和DNA雜合循環(huán)探針，RNase H，以及針對性引物，可以高效、準(zhǔn)確地鑒別ts-11株和非ts-11株。該方法可在1小時(shí)內(nèi)鑒定出目標(biāo)株，從而實(shí)現(xiàn)MG的快速檢測以及ts-11疫苗株與非ts-11株的快速鑒別診斷。
材料與方法
病原
雞傳染性支氣管炎病毒（IBV）、新城疫病毒（NDV）、禽流感病毒（AIV）、禽腺病毒（FAdV）、傳染性喉氣管炎病毒（ILTV）、傳染性法氏囊病病毒（IBDV）、雞貧血病毒（CAV）、馬立克氏病病毒（MDV）、MS和鼻氣管鳥桿菌（ORT）等均由山東信得科技股份有限公司檢測中心保存。所有病毒及MS和ORT均采用特異性PCR方法進(jìn)行鑒定。
引物和探針
研究表明，pot C基因可作為鑒別ts-11疫苗株與野毒株（Sulyok等，2019）的靶基因。從GenBank下載ts-11株 （CP044225.1）和代表性非ts-11株（野生型（CP006916.3）、6/85（CP044224.1）和F株（NC017503.1））的pot C基因序列。利用Snap Gene軟件（version 3.1.4）針對ts-11株pot C基因中含有單點(diǎn)突變的保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物。采用金斯瑞qPCR（TaqMan）在線引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)探針（https://www.genscript.com/tools/real-timepcr-taqman-primer-design-tool）。所用引物和探針由寶生物工程（大連）有限公司合成，見表1。
表1 引物和探針序列
核酸提取及重組質(zhì)粒的制備
使用VNP-32P全自動核酸提取儀和諾維贊DNA/RNA提取試劑盒提取AIV、IBV、NDV、FAdV、ILTV、IBDV、CAV、MDV、MS、ORT和所有拭子樣品的核酸。重組質(zhì)粒pts-11和pnon-ts-11分別克隆有ts-11株和非ts-11株的pot C部分基因，由寶生物工程（大連）有限公司合成。
Cycleave qPCR反應(yīng)程序
Cycleave qPCR反應(yīng)體系為25 μL，包括12.5 μL的Cycleave PCR Mix（2×Conc.），上游引物（10 μM）和下游引物（10 μM）各0.5 μL，ts-11探針（5 μM）和非ts-11探針（5 μM）各1 μL，模板2 μL，滅菌水7.5 μL。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性30s；95℃變性10s，60℃退火30s，72℃延伸20s，共40個(gè)循環(huán)。延伸時(shí)進(jìn)行熒光信號檢測，根據(jù)擴(kuò)增曲線和Ct值判斷結(jié)果。qPCR使用Roche Light Cycler 480進(jìn)行。以200 RFU的熒光信號作為cycleave qPCR檢測的閾值，Ct≤36判為陽性。
標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立
用微量分光光度計(jì)測定pts-11和pnon-ts-11重組質(zhì)粒的濃度，并計(jì)算各自的拷貝數(shù)。然后將質(zhì)粒在無菌水中進(jìn)行10倍倍比稀釋（108~103），作為cycleave qPCR的模板。每個(gè)稀釋度重復(fù)3次，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。反應(yīng)體系和程序同上，利用軟件計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線參數(shù)，包括效率、斜率和R2。
特異性、敏感性和重復(fù)性分析
為了驗(yàn)證特異性，以提取的AIV、IBV、NDV、FAdV、ILTV、IBDV、CAV、MDV、MS和ORT基因組為模板，進(jìn)行cycleave qPCR擴(kuò)增。并用104稀釋的pts-11和pnon-ts-11質(zhì)粒作為陽性對照，無菌水作為陰性對照。
為了檢測cycleave qPCR的敏感性，將兩個(gè)質(zhì)粒分別做102~1011連續(xù)稀釋，作為cycleave qPCR和常規(guī)PCR的模板，以無菌水作為陰性對照。為了確定cycleave qPCR的重復(fù)性和穩(wěn)定性，將pts-11和pnon-ts-11質(zhì)粒10倍倍比稀釋（104~106）作為cycleave qPCR的模板；在批內(nèi)和批間重復(fù)試驗(yàn)中，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)。批間重復(fù)試驗(yàn)的時(shí)間間隔為1周。根據(jù)公式CV =（SD [ Ct值] /總體平均值[ Ct值]）×100計(jì)算變異系數(shù)（CV）。
臨床樣品檢測
采集2022年山東、黑龍江和廣東三省免疫M(jìn)G ts-11疫苗35天后的10個(gè)規(guī)?；u場的雞上顎裂拭子300份。樣品的采集經(jīng)山東信得科技股份有限公司實(shí)驗(yàn)動物管理與倫理委員會批準(zhǔn)（QXRZ：2021-007）。利用建立的Cycleave qPCR方法進(jìn)行檢測，同時(shí)與商品化MG通用qPCR試劑盒（英賽特）的檢測結(jié)果進(jìn)行比對。此外，從兩個(gè)飼養(yǎng)和管理?xiàng)l件相似，但MG疫苗免疫程序不同的大型養(yǎng)殖場采集臨床樣本，以評估免疫效力。
結(jié)果
標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立
根據(jù)檢測結(jié)果繪制ts-11株和非ts-11株的標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖1和表2。斜率分別為-3.303和-3.410，R2值分別為0.9993和0.9987，擴(kuò)增效率分別為100.8%和98.4%。ts-11株批內(nèi)重復(fù)性CV為0.32%~0.82%，非ts-11株批內(nèi)重復(fù)性CV為0.91%~1.13%。此外，ts-11株批間重復(fù)性CV為0.40%~0.51%，非ts-11株批間重復(fù)性CV為0.63%~0.95%（表3）。
圖1. Cycleave qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線。ts-11株質(zhì)粒pts-11從2.43×103倍比稀釋到2.43×108拷貝/mL（A）；非ts-11株質(zhì)粒pnon-ts-11從1.65×103倍比稀釋到1.65×108拷貝/mL（B）。
表2 Cycleave qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果
Cycleave qPCR方法的特異性、敏感性和重復(fù)性
選取AIV、IBV、NDV、FAdV、ILTV、IBDV、CAV、MDV、MS和ORT等常見雞源病原，對建立的cycleave qPCR方法進(jìn)行特異性驗(yàn)證。結(jié)果顯示，與陰性對照相同，這些病原cycleave qPCR檢測結(jié)果均為陰性（圖2）。
圖2. Cycleave qPCR特異性評估。ts-11疫苗株（A）；非ts-11株（B）。P：陽性對照；A：AIV；B：IBV；C：NDV；D：FAdV；E：ILTV；F：IBDV；G：CAV；H：MDV；I：MS；J：ORT；N：陰性對照。
將質(zhì)粒進(jìn)行10倍倍比稀釋，根據(jù)質(zhì)?？截悢?shù)評估cycleave qPCR檢測方法的敏感性。結(jié)果表明，ts-11株（圖3A）和非ts-11株（圖3B）的cycleave qPCR敏感性分別為2.43拷貝/μL和1.65拷貝/μL。常規(guī)PCR方法對ts-11疫苗株（圖4A）和非ts-11株（圖4B）的敏感性分別為2.43×103拷貝/μL和1.65×103拷貝/μL。cycleave q PCR方法的敏感性比常規(guī)PCR方法高1000倍。
圖3. Cycleave qPCR敏感性評估。ts-11株質(zhì)粒pts-11從102倍比稀釋到1010（A）；非ts-11株質(zhì)粒pnon-ts-11從102倍比稀釋到1010（B）。N：陰性對照。
圖4. 普通PCR檢測ts-11株和非ts-11株電泳圖。ts-11株質(zhì)粒pts-11從102倍比稀釋到1010（A）；非ts-11株質(zhì)粒pnon-ts-11從102倍比稀釋到1010（B）。N：陰性對照；M：DNA標(biāo)準(zhǔn)。
為評價(jià)cycleave qPCR的重復(fù)性和穩(wěn)定性，進(jìn)行批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗(yàn)，所有cycleave qPCR均重復(fù)3次，計(jì)算Ct和CV的平均值。結(jié)果顯示，ts-11株批內(nèi)重復(fù)性CV為0.32%~0.82%，非ts-11株批內(nèi)重復(fù)性CV為0.91%~1.13%。此外，ts-11株的批間重復(fù)性CV為0.40%~0.51%，非ts-11株的批間重復(fù)性CV值為0.63%~0.95%（表3）。
表3 Cycleave qPCR批內(nèi)和批間重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果
臨床樣品檢測
共采集300份免疫ts-11株35天后的雞上顎裂拭子。ts-11株陽性率為70% （210/300），非ts-11株陽性率為20%（60/300），其余30份檢測結(jié)果均為陰性，與商品化MG通用qPCR檢測試劑盒的結(jié)果一致性為100%。
A公司分別在25日齡和45日齡免疫一次ts-11疫苗，B公司僅在21日齡免疫ts-11疫苗。在免疫后不同時(shí)間采集上顎裂拭子，利用建立的cycleave qPCR方法評價(jià)免疫效果。結(jié)果顯示，兩次免疫的效果（圖5A）優(yōu)于一次免疫的效果（圖5B）。
圖5. MG ts-11疫苗免疫后不同時(shí)間陽性率。A公司在25日齡和45日齡分別免疫一次（A）；B公司在21日齡免疫一次（B）。
討論
MG ts-11的疫苗于1988年首次在澳大利亞上市，推廣20余年，在全球60多個(gè)國家應(yīng)用 (Ley等，1997; Muneta等，2008; Noormohammadi and Whithear, 2019)。該疫苗可持續(xù)定植于上呼吸道，阻止野毒株入侵，保護(hù)關(guān)節(jié)和輸卵管，提高雞蛋品質(zhì)（Vance等，2009 ; Jacob等，2015）。然而，普通方法無法準(zhǔn)確區(qū)分ts-11株與非ts-11毒株，因此，難以了解MG在雞群中的流行狀態(tài)，特別是免疫過MG ts-11疫苗并且發(fā)生MG野毒感染的雞群。由于缺乏準(zhǔn)確快速的檢測方法，極大地限制了區(qū)分疫苗株和非疫苗株、評估臨床免疫效果、監(jiān)測雞群健康以及預(yù)防和控制MG感染的能力。
目前MG的診斷主要依靠分離培養(yǎng)、抗體檢測、分子生物學(xué)檢測 （Feberwee等，2022）。分離培養(yǎng)是檢測MG的金標(biāo)準(zhǔn)，但致病性MG是一種生長緩慢且對培養(yǎng)條件相對苛刻的微生物，可能需要長達(dá)3周的時(shí)間才能檢測出來。PCR方法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、快速、簡便、價(jià)格相對低廉等優(yōu)點(diǎn)，可用于直接檢測臨床樣本而不需要分離培養(yǎng)（Leurs等，2022）。
為了區(qū)分ts-11株和非ts-11株，科學(xué)家們進(jìn)行了許多研究。Raviv等開發(fā)了5種qPCR方法，可將3種商品化疫苗株和2種實(shí)驗(yàn)室候選疫苗株（F，ts-11，6/85，K5831和K5054）與野毒株（Rlow）進(jìn)行區(qū)分。然而，該方法的適用性有限，無法在更多場合中使用（Raviv等，2008）。DNA指紋圖譜分析方法需要純培養(yǎng)，重復(fù)性低，操作步驟冗長，且缺乏實(shí)驗(yàn)室間的比對數(shù)據(jù)（Hong等，2005 ; Naziri等，2016 ; Mateen等，2021）。熔解曲線法和基于瓊脂糖凝膠的錯配擴(kuò)增突變檢測法（MAMAs），可區(qū)分MG疫苗株和野毒株。然而，由于該檢測靈敏度適中，DNA載量較低的臨床樣本可能會產(chǎn)生假陰性結(jié)果（Sulyok等，2019）。
因此，需要開發(fā)一種簡單、快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)的檢測方法。特別是對于單堿基突變，常規(guī)PCR無法進(jìn)行區(qū)分，解決當(dāng)前的鑒別難題。本研究開發(fā)的cycleave qPCR，探針為循環(huán)探針，它是一種由RNA和DNA組成的雜合探針，當(dāng)與RNase H共同使用時(shí)，該方法表現(xiàn)出高度靈敏性和特異性。當(dāng)探針與互補(bǔ)的DNA序列形成雜合體時(shí)，可以被RNase H切割，解除淬滅抑制，促進(jìn)熒光物質(zhì)發(fā)出熒光（Yamada等，2021）。通過測量熒光強(qiáng)度可以實(shí)時(shí)對產(chǎn)物進(jìn)行監(jiān)測。因此，這是一種高度特異性的檢測方法，即使只有一個(gè)堿基的變化也能識別差異。與傳統(tǒng)的熒光PCR相比，該探針一般由大約12個(gè)堿基組成，熒光報(bào)告基團(tuán)與淬滅基團(tuán)接近，淬滅效果好，熒光背景低，信噪比高。
本研究建立的cycleave qPCR方法可在1 h內(nèi)特異性區(qū)分ts-11株和非ts-11株，與AIV、IBV、NDV等常見禽病病原無交叉反應(yīng)。Cycleave qPCR具有較高的敏感性，對ts-11株的檢測極限為2.43拷貝/μL，對非ts-11株的檢測極限為1.65拷貝/μL。批內(nèi)和批間CV均小于1.13%。在臨床樣品檢測中，cycleave qPCR與商品化MG通用qPCR試劑盒的一致性為100%，可有效評價(jià)MG ts-11疫苗在雞群中的免疫效果。需要說明的是，該方法只能區(qū)分ts-11疫苗株和非ts-11疫苗株，包括野毒株和其他疫苗株（F和6/85）。如果需要區(qū)分疫苗株（包括ts-11、F和6/85）和野生株，建議聯(lián)合使用其他方法。
綜上所述，本研究建立了cycleave雙探針熒光定量PCR方法。該方法操作簡單、靈敏度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、效率高。尤其是該方法可以同時(shí)檢測MG ts-11株和非ts-11株。目前，ts-11活疫苗是主要的MG疫苗，在我國應(yīng)用廣泛，在MG防控的臨床實(shí)踐中發(fā)揮了重要作用。Cycleave qPCR的建立將極大地促進(jìn)MG ts-11活疫苗的應(yīng)用和MG感染的防控，已在臨床上得到證實(shí)。在我國，從商品雞群中根除MG的計(jì)劃已經(jīng)提上了日程，本研究建立的cycleave qPCR方法將在MG感染的流行病學(xué)監(jiān)測中發(fā)揮重要作用。