* 本文摘自：中國畜禽種業(yè)
* 作者：蔡曼珊，王晨燕，陳銘怡，侯 博，瞿 浩
滑液囊支原體（Mycoplasma synovia，MS）是感染雞和火雞的一種致病性病原體，目前已廣泛存在于我國不同品種雞群中。MS活疫苗免疫是一種有效的防控手段，評(píng)價(jià)MS疫苗在商品雞群中的免疫效果，對(duì)于開展MS防控技術(shù)研究具有十分重要的意義，且可以為臨床生產(chǎn)實(shí)踐中MS感染防控積累經(jīng)驗(yàn)。本研究嘗試在黃羽肉種雞中免疫M(jìn)S-H株疫苗后，定期對(duì)雞群血清抗體和上顎裂拭子中的MS-H疫苗菌株和野毒菌株進(jìn)行監(jiān)測(cè)，對(duì)MS-H株在雞群中的定殖能力和定殖維持時(shí)間進(jìn)行評(píng)估，科學(xué)評(píng)估MS-H疫苗使用后對(duì)于MS野毒菌株感染的預(yù)防效果，為有效防控MS提供新的技術(shù)支持，為臨床科學(xué)防控雞群MS的感染提供科學(xué)方法或理論依據(jù)，為后續(xù)開展滑液囊支原體病的綜合防控技術(shù)研究奠定基礎(chǔ)。
1 材料和方法
1.1 主要試驗(yàn)材料
MS-H株、TS-11株疫苗購自青島信得藥業(yè)有限公司，其由澳大利亞生物資源公司生產(chǎn)；MS抗體檢測(cè)試劑盒Mycoplasma Synoviae Antibody Test Kit購自BioChek公司；細(xì)菌DNA提取試劑盒購自北京天根生物科技有限公司；可鑒別疫苗株MS-H和野毒菌株的雞滑液囊支原體雙重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)試劑盒購自山東信達(dá)基因科技有限公司。
1.2 動(dòng)物試驗(yàn)設(shè)計(jì)
選取一個(gè)黃羽肉種雞父母代場(chǎng)，同一個(gè)品種共6個(gè)批次雞群。每個(gè)批次在1～14日齡使用兩輪支原體敏感抗生素進(jìn)行藥物預(yù)防，21日齡免疫TS-11和MS-H各1羽份、90日齡再免疫M(jìn)S-H活疫苗1羽份，全程不免疫M(jìn)S滅活疫苗，14日齡后不使用支原體敏感抗生素。從1日齡開始以大約2周的間隔定期跟蹤采樣，每批雞每次隨機(jī)采集24份血液樣品和24份上顎裂拭子，其中每3份上顎裂拭子合并為1個(gè)混合樣品，實(shí)行3合一檢測(cè)。將采集的上顎裂拭子置于3mL的PBS緩沖液中，-20℃保存用于MS病原熒光定量PCR檢測(cè)。
1.3 血清抗體的檢測(cè)
將采集的血液37℃放置4h，2～8℃放置6h后，1000r/min離心10min后分離血清，-20℃保存用于MS抗體檢測(cè)。采用BioChek公司MS抗體檢測(cè)試劑盒，按照試劑盒說明書對(duì)血清中的MS抗體進(jìn)行檢測(cè)。
1.4 MS-H株和MS野毒菌株的熒光定量PCR檢測(cè)
樣品前處理參照中華人民共和國國家行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《禽支原體PCR檢測(cè)方法》（NYT 553—2015）進(jìn)行。采用山東信達(dá)基因科技有限公司雞滑液囊支原體雙重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)試劑盒，按照說明書進(jìn)行MS-H疫苗株和野毒菌株的檢測(cè)。
2 結(jié)果
2.1 MS抗體檢測(cè)結(jié)果
由圖1可知，所有雞群的雞在1日齡采樣檢測(cè)MS抗體均呈現(xiàn)陽性，平均滴度在3000～5000，隨著日齡的增加母源抗體水平逐漸降低，在14、28、42日齡時(shí)MS抗體基本呈現(xiàn)陰性，且陽性率較低。在21日齡進(jìn)行MS-H疫苗免疫后，所有雞群在56日齡陸續(xù)出現(xiàn)MS抗體轉(zhuǎn)陽。
圖1 MS-H株疫苗免疫的6批次父母代黃羽肉種雞MS抗體檢測(cè)
在6批雞群中有4批雞群在56日齡前沒有檢測(cè)到野毒（圖2），說明56日齡檢測(cè)到的抗體主要來源于疫苗免疫，即活苗免疫后28d可以陸續(xù)產(chǎn)生抗體，逐漸出現(xiàn)MS抗體轉(zhuǎn)陽，但此時(shí)的平均抗體滴度較低，一般在2000以下。雞群20211112批在56日齡的MS抗體陽性程度較高，其平均滴度接近5000（圖1），結(jié)合病原監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)，該批雞在42日齡發(fā)生了較嚴(yán)重的MS野毒感染。MS抗體轉(zhuǎn)陽后滴度水平較少升高至5000，這與MS野毒感染的滴度抗體水平達(dá)到10000，甚至30000相比，疫苗免疫的MS抗體水平較低，且MS抗體水平起伏較小。在140日齡雞群準(zhǔn)備開產(chǎn)時(shí)，6批雞抗體陽性率在56%～95%，此時(shí)抗體滴度處于養(yǎng)殖全期高峰，后續(xù)沒有野毒持續(xù)刺激的情況下，在200日齡前后抗體滴度下降到2000左右（圖1）。
2.2 MS病原的熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果
6批次雞群中，2批次在42日齡首次檢出野毒菌株，陽性率分別為100%、37.5%。另外4批次群分別在70、70、84、112日齡檢出野毒菌株，且陽性率均在25%以下（圖2）。
MS-H疫苗菌株定殖和維持方面：6批雞群在疫苗免疫后1周均檢出了MS-H株，大部分雞群在免疫后3～5周定殖率達(dá)到了最高，均超過了80%，部分雞群的定殖率可達(dá)100%（圖3）；維持方面，檢測(cè)結(jié)果顯示直到52周齡，MS-H株的檢出率仍維持在62.5%～87.5%（圖3），說明雞群在90日齡前進(jìn)行兩次MS-H株活苗免疫，在雞群中定殖率較高，且維持時(shí)間較長(zhǎng)。通過對(duì)整個(gè)飼養(yǎng)周期野毒菌株和MS-H疫苗株的檢測(cè)結(jié)果分析，發(fā)現(xiàn)飼養(yǎng)期間即使出現(xiàn)多批次野毒菌株反復(fù)感染的情況，但除了2批雞在42日齡出現(xiàn)一次100%、37.5%野毒菌株感染外，其他的野毒菌株陽性率均未超過25%，未出現(xiàn)大范圍的MS野毒感染（圖2和圖3），說明即便試驗(yàn)周期內(nèi)存在早期MS野毒菌株的感染，但并未在雞群中大范圍的蔓延和擴(kuò)散。
圖2 MS-H株疫苗免疫的6批次父母代黃羽肉種雞MS野毒感染檢測(cè)
圖3 MS-H株疫苗免疫的6批次父母代黃羽肉種雞MS-H株疫苗定植檢測(cè)
3 討論
從2010年至今，滑液囊支原體感染給我國養(yǎng)雞行業(yè)造成了嚴(yán)重的危害和損失，MS可以水平傳播和垂直傳播，一旦感染就會(huì)在雞體內(nèi)終生定殖。雖然各大養(yǎng)殖企業(yè)都采取了加強(qiáng)生物安全措施、支原體敏感抗生素使用、支原體滅活疫苗免疫等手段，但MS在中國仍然廣泛流行。因此，目前的防控方法都無法阻止MS野毒在雞群中的水平傳播，尤其是在多日齡混養(yǎng)的雞場(chǎng)，MS野毒在雞場(chǎng)循環(huán)感染，造成雞群生產(chǎn)性能受到嚴(yán)重影響。
本研究旨在評(píng)估MS-H株疫苗在黃羽肉種雞父母代雞群中的定殖效果和定殖時(shí)間，評(píng)價(jià)MS-H株預(yù)防和阻止MS野毒菌株感染的能力，給養(yǎng)殖企業(yè)提供一個(gè)有效控制MS野毒菌株感染的方案。有研究表明在SPF雞當(dāng)MS-H株免疫劑量等于或大于4.8×105CCU時(shí)，免疫后6周進(jìn)行攻毒，免疫雞的氣囊損傷程度、氣囊損傷發(fā)生率顯著降低，MS攻毒毒株在氣管和氣囊的定殖率均顯著下降[13]，且MS-H株誘導(dǎo)的保護(hù)性免疫在疫苗接種后至少可維持40周[14]。本研究通過在規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)連續(xù)對(duì)6批次雞群免疫后，定期跟蹤MS抗體水平以及對(duì)MS-H株疫苗菌株和MS野毒菌株的檢測(cè)來看，通過滑液囊支原體活疫苗MS-H的2次免疫，疫苗株可以在雞體內(nèi)終生定殖，且MS野毒菌株的感染率較低。MS-H株活疫苗免疫可以降低MS野毒菌株攻毒的氣管中的載量和在雞群中的水平傳播，可以使MS陽性的多日齡農(nóng)場(chǎng)轉(zhuǎn)為MS感染陰性[15]。本研究通過對(duì)6批次雞群采用MS-H株疫苗兩次免疫后，大部分雞群在免疫后3～5周MS-H株定殖率達(dá)到了最高，均超過了80%，部分雞群的定殖率可達(dá)100%，直到52周齡MS-H株的檢出率仍維持在62.5%～87.5%，在野毒菌株檢測(cè)方面發(fā)現(xiàn)除了2批雞在42日齡出現(xiàn)一次100%、37.5%野毒菌株感染外，其他的野毒菌株陽性率均未超過25%，未出現(xiàn)大范圍的MS野毒感染。有研究表明MS-H株的免疫可以成功的替換雞群中的MS野毒菌株[15]，而MS滅活疫苗免疫卻不能阻止MS的感染[16]，本研究中的6批次雞群MS野毒菌株未發(fā)生嚴(yán)重感染可能與MS-H株免疫阻斷MS野毒菌株的水平傳播和替換雞群中已感染的MS野毒菌株相關(guān)。因此從本研究中的6批雞免疫后的抗體水平監(jiān)測(cè)、疫苗菌株在雞群的定殖和野毒在雞群的感染情況監(jiān)測(cè)，生產(chǎn)上可以通過定期監(jiān)測(cè)疫苗定殖率、野毒率、以及抗體滴度、抗體離散度來判斷雞群免疫是否成功以及野毒感染情況。由于種雞感染MS后，可造成蛋殼質(zhì)量變差、孵化率下降以及引起垂直傳播，因此在種雞中的支原體疫苗免疫的最主要目的是避免中大雞或產(chǎn)蛋雞的MS野毒菌株感染。在本研究的20211112批的雞群中，雞群在42日齡已經(jīng)監(jiān)測(cè)到100%野毒感染，56日齡抗體滴度接近5000，即使雞群已經(jīng)進(jìn)行了活疫苗免疫，且活疫苗定殖率最高時(shí)達(dá)到100%，仍然出現(xiàn)了早期嚴(yán)重的野毒感染和不同日齡野毒的多次檢出。提示在生產(chǎn)上，除了做好疫苗免疫外，要抓好飼養(yǎng)管理，包括雞群健康、生物安全、環(huán)境消毒等，采取綜合措施以減少野毒菌株在雞群的水平感染。本研究結(jié)果顯示MS-H株疫苗的使用以及在雞群的定殖可能會(huì)阻止MS野毒菌株的感染，控制MS感染在雞群的水平擴(kuò)散和傳播，這將為控制和根除MS感染具有重要作用。
4 結(jié)論
商品化的MS-H株疫苗黃羽肉種雞群中，進(jìn)行2次免疫，可以成功的阻止MS野毒株在雞群中的水平傳播能力，降低MS野毒株的感染率。